新一代测试。 俄罗斯科学家创建了一个基于 Crispr-cas12 的新一代快速测试平台

Newswise – 分子生物学和生物技术的发展使得创建许多生物传感器和诊断测试成为可能 – 从对 COVID-19 的快速分析到对农业植物病原体的快速测试。 俄罗斯科学院“生物技术基础”联邦研究中心的科学家们创造了DIRECT2平台,该平台可以催生基于CRISPR-Cas12系统的新一代快速测试,并以脱氧核糖核酸 德基亚·索拉尼 一种危害农业植物的细菌。 生物技术专家描述了新平台的工作原理,并将其与生物传感器和生物电子学杂志中的其他方法进行了比较。

来自 CRISPR(规则间隔短对称重复序列)基因部分的系统(存储有关先前检测到的病毒的信息)和 Cas 组核酸内切酶蛋白(CRISPR 相关蛋白)提供对细菌的免疫力,保护它们免于再次感染相同的病毒。 这些系统的可编程性和基因靶标识别的显着特异性使得它们可以用于基因组编辑。 近年来,CRISPR-Cas系统也开始用于生物传感器,它以高灵敏度识别特定的DNA和RNA序列。 俄罗斯科学家创建了一个新平台,该平台结合了 CRISPR-Cas 技术、通用 DNA 蛋白探针和快速跨膜测试,为非系统诊断提供了高精度。

用向导 RNA 合成的 Cas12 蛋白在测试中识别 DNA 靶标,并将其序列与向导 RNA 进行比较——就像在细菌细胞中一样,有一个过程来验证有关先前检测到的病毒的信息。 然后,CRISPR-Cas12 复合物切割 DNA 靶标并获得一次又一次切割任何单链 DNA 的能力。 使用带有可检测标记(DNA 探针)的单链 DNA,可以记录该标记的版本,例如,借助膜分析。 这显示了在测试中存在目标 DNA 的情况下测试线染色,而在阴性测试中不存在。 测试过程不需要复杂的设备,只需最少的操作员支持,就可以在现场条件下进行。 然而,在预制产品中,测试中还附加了一个未分级的 DNA 探针,它会扭曲分析结果。

为了解决这一难题,研究作者设计了一种生物传感器,在放置探针的支架上,包含一个 DNA 片段(具有功能基团的单链 DNA – 半抗原)和一个蛋白质片段(大鼠抗半抗原)。 )。 激活剂是切割探针的 Cas12 核酸靶蛋白。 由于抗体与放置在膜上和金纳米粒子表面上的鼠抗体特异性结合,释放的构建体通过横向流动测定法检测。 该平台被称为 DIRECT2(缩写自 DNA-Immunoglobulin Check Endonuclease Report)。

Boris Dzantiev,教授,科学博士。 (化学),俄罗斯科学院联邦研究中心“生物技术基础”免疫生物化学实验室负责人:

“现代分子诊断方法已超越聚合酶链式反应 (PCR) 测试的控制点,成为唯一高度敏感的工具。生物技术正在创新新方法,显着缩短测试时间,使单个病毒或细菌能够在最重要的是,诊断可以在床边、医生办公室和任何其他没有配备实验室的地方随身携带 得益于等温扩增和 CRISPR-Cas 等新技术,快速测试正成为实验室诊断的可靠替代方案用于准确识别 DNA/RNA 靶标的系统。

DIRECT2 是俄罗斯第一个使用高度敏感和特殊的 CRISPR-Cas 系统进行诊断的技术。 除了发表我们的结果外,中国同事在《Angewandte Chemie 国际版》上发表了一篇文章,该文章还介绍了借助试纸对 CRISPR-Cas12 反应产物的可靠检测。 目前,这些工作可以被认为是使用CRISPR-Cas系统进行新一代快速测试的开始。

该平台是一个灵活的系统,可以根据手头的任务进行更改和开发,并适应识别不同的病原体。 此外,探索复合探针的载体和其他组件将是有用的。

俄罗斯科学院“生物技术基础”联邦研究中心免疫组织化学高级研究员 Irina Savinkova 博士(生物学):

“用户看到使用 CRISPR-Cas12 进行快速测试的阳性结果是在试纸条上出现两条线(测试 1 区,T 区和对照区,C 区)。您可以看到这些线,这要归功于彩色但是在使用 DIRECT2 平台时,所获得的测试内容、分子过程和结果的可靠性与以前使用的测试有很大不同。

CRISPR-Cas12 的常规快速检测按照这个方案进行:试纸条捕获整个 DNA 探针和 C 区的纳米颗粒,不允许它们进入 T 区。DNA-target 激活 Cas12,切割 DNA探测。 DNA 切割 – 探针成为纳米颗粒进入 T 区的通道。该方案的一个严重缺点是存在获得假阳性结果的风险。 纳米粒子在各种因素的影响下可以被允许进入T区,探针片与T区染色之间没有一对一的接触。导致它们染色,没有 DNA 探针切割是不可能的。 该方案提供了高测试可靠性。

DIRECT2 Load Package – 分析包括反应混合物和两种成分。 第一个成分是蛋白质-DNA 复合探针,它吸附在微孔板孔中的载体或磁性颗粒上。 通过切割探针,其蛋白质片段被释放。 第二个组件是检测探针蛋白质部分的测试条。 通过用活化的 Cas12 切割 DNA 探针对 T 区域进行染色。 无论测试内容如何,​​区域 C 始终是彩色的。


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